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タンパク質複合体合成への応用 | 株式会社セルフリーサイエンス

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アプリケーションノート

タンパク質複合体合成への応用

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はじめに

エイズの病原ウィルスであるHIV の感染者は世界中で約3670 万人を越え、毎年ほぼ180 百人が新たに感染しています(2016 年末時点)。現在ではカクテル療法の確立により、感染患者の生命予後は改善された一方で、既存の薬剤に対する耐性が現れており、新規治療法が常に期待され様々な研究が進められています。エイズの病原ウィルスであるHIV の感染者は世界中で約3670 万人を越え、毎年ほぼ180 百人が新たに感染しています(2016 年末時点)。現在ではカクテル療法の確立により、感染患者の生命予後は改善された一方で、既存の薬剤に対する耐性が現れており、新規治療法が常に期待され様々な研究が進められています。細胞内の情報伝達制御因子SOCS1 は、HIV 感染細胞内で発現が誘導され、ユビキチンリガーゼコンプレックスを形成し核の周囲でウィルス粒子構成因子のGag タンパク質の細胞間輸送と安定化していると考えられています。今回、コムギ無細胞タンパク質合成システムの利点を活かした共発現により、SOCS1 を含む4 種類のタンパク質から構成されるユビキチンリガーゼコンプレックスE3 複合体の合成を試みました。

 

方法

SOCS1 は、他の4種類のタンパク質、Culllin2, Rbx1, B (Elongin B), C (Elongin C) と複合体を形成します (図1)。

  

        

protein complexes1 

 

protein complexes3

 

図1  精製されたE3複合体の模式図

        

図2  E3 複合体合成・精製の流れ

 

 

それぞれの遺伝子をコムギ無細胞タンパク質合成専用発現ベクターpEUベクターにクローニングし、発現鋳型を構築しました。プレ試験にてそれぞれ単独で合成した際にもっとも収量の少なかったCullin2のN末端に、合成後のプルダウンにより精製するためのGST-tag遺伝子およびGSTを切り出すためのプロテアーゼサイトを付加しました2

構築したそれぞれの鋳型からmRNAを転写合成した後、それぞれのmRNAとコムギ胚芽抽出液WEPRO®7240Gおよび基質SUB-AMIX® SGCと共に透析カップに分注し共発現しました。合成後はGSTによるアフィニティー精製およびプロテアーゼ処理(PreScission Protease)により GST-Tagを切り出しE3複合体を精製しました。精製されたE3複合体はMicroconを用いて濃縮・バッファー交換を行いました。

 

protein complexes2 

図3  透析カップを用いた翻訳反応

結果

 図4において、 SDS-PAGE/CBB染色による確認により、E3複合体の精製産物が得られました。

 

 

protein complexes4 

図4   E3 複合体の合成・精製結果

 

 

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参考文献

M. Nishi et al. (2009) Requirement for microtubule integrity in the SOCS1-mediated intracellular dynamics of HIV-1 Gag FEBS Letters 583 1243-1250.M. Nishi et al. (2009) Requirement for microtubule integrity in the SOCS1-mediated intracellular dynamics of HIV-1 Gag FEBS Letters 583 1243-1250.

 

使用製品

WEPRO7240 Expression Kit

WEPRO7240G  Expression Kit

タンパク質合成に必要な試薬類がセットがなっています。

少量スケール多サンプル合成、目的タンパク質の大量合成などに最適です。

WEPRO7240

WEPRO7240G

GSTタグアフィニティー精製用に最適化されたコムギ胚芽抽出液

SUB AMIX SGC 2

SUB-AMIX SGC

WEPRO7240シリーズ用の翻訳反応基質溶液です。

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